Monodiscos EDTA

Método simple y sencillo, utilizado en las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos para la detección fenotípica de enzimas metalo-beta-lactamasas (MBLs).

Fundamento

Las metalo-beta-lactamasas son enzimas que pertenecen a la clase B de Ambler y al grupo 3 según la clasificación funcional de Bush-Jacoby-Medeiros. Característicamente, estas enzimas son inhibibles por agentes quelantes de cinc, como ser el EDTA y el SMA (mercaptoacetato de sodio). Han sido aisladas y reportadas en numerosos países, incluida la Argentina. Los genes que las codifican pueden estar localizados a nivel cromosómico o plasmídico. Estas enzimas hidrolizan una gran variedad de antibióticos β-lactámicos, incluyendo penicilinas, cefalosporinas (1ª, 2ª, 3ª y 4ª generación) y carbapenemes. No actúan, in vitro, sobre aztreonam. El hecho de actuar sobre carbapenemes hace que su importancia clínica sea aún mayor, ya que estos antibióticos, debido a su amplio espectro de acción y a su estabilidad frente a la acción de enzimas β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), son utilizados como último recurso para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos Gram negativos resistentes a otros antibióticos β-lactámicos. Además, se han publicado diversos trabajos documentando la diseminación de este tipo de enzimas en el ámbito hospitalario, resaltando su importancia epidemiológica. Esto conduce a que la detección de enzimas metalo-beta-lactamasas sea determinante para dirigir el tratamiento óptimo de los pacientes y para controlar la diseminación de la resistencia. Sin embargo, los puntos de corte de los métodos habituales utilizados en las pruebas de sensibilidad a los antibacterianos presentan algunas limitaciones para detectar bacterias con metalo-beta-lactamasas. De aquí la importancia de contar con un método fenotípico, rápido, práctico y simple, para detectar microorganismos que posean estas enzimas.

Composición de los Monodiscos EDTA

EDTA (ácido etilendiamino tetraacético): 372 ug.

Mercaptoacetato de sodio: 900 ug.

Metodología de empleo de los Monodiscos EDTA

Método de Difusión en Agar Mueller Hinton según normas CLSI” (*)

Para la detección de enzimas metalo-beta-lactamasas se sigue el método de la doble difusión de discos, como se describe a continuación:

-Colocar 1 disco de imipenem (10 µg) y un disco de EDTA a una distancia de 15 mm de borde a borde de ambos discos.

-Colocar 1 disco de meropenem (10 µg) a una distancia de 15 mm del disco de EDTA (de borde a borde de ambos discos), contrapuesto al de imipenem.

Interpretación

Una prueba positiva consiste en la observación del agrandamiento de la zona de inhibición del desarrollo alrededor del disco de imipenem (10 µg) o meropenem (10 µg) hacia el disco de EDTA. Este fenómeno de agrandamiento es conocido comúnmente como “Efecto Huevo”.

Una prueba negativa se considera cuando hay ausencia del agrandamiento de la zona de inhibición del desarrollo alrededor del disco de imipenem (10 µg) y meropenem (10 µg) hacia el disco de EDTA.

Almacenamiento

Entre -20 y 0°C para mantener su potencia. Las cantidades necesarias para el trabajo semanal (7 días) pueden mantenerse refrigeradas entre 2-8 °C.

Permita que los recipientes alcancen la temperatura 10-35 ºC antes de abrirlos.

Presentación
X 50 Discos	Código:   B12-417-27

(*) “Método de Difusión en Agar Mueller Hinton según normas CLSI”

a) Preparación de las placas con el medio de cultivo:

• Medio: el medio a utilizar es el agar Mueller Hinton. Debe controlarse que el pH del mismo se encuentre entre 7.2 y 7.4.
• Volumen del medio por placa: debe verterse 25 a 30 ml. de agar fundido y enfriado a 50-55 ºC en placas estériles de vidrio o plástico, de modo de obtener una capa de 4mm de alto. Es fundamental respetar esta condición, pues de lo contrario, se obtendrán halos mayores o menores según el caso.
• Secado de las placas: para eliminar la humedad sobre la superficie del medio, las placas deben secarse incubándolas a 35-37 ºC durante 30-60 minutos.

b) Muestra:

Condiciones de los cultivos originales: el ensayo para la detección de enzimas metalo-beta-lactamasas, se realiza a partir de cultivos monomicrobianos de la cepa en estudio.

• Preparación del inóculo: se toman de 3 a 5 colonias del cultivo original con un ansa de nichrome, se introducen en 5 ml de caldo tripteina soya y se ajusta la turbidez al equivalente del tubo 0.5 de la escala de Mc Farland.

El tubo testigo se prepara añadiendo 0.5ml de 0.048 M BaCl2 (1.175 % p/v BaCl2 2 H2O) a 99.5 ml de 0.36 NH2SO4 (1% v/v). La turbidez se verifica en un espectrofotómetro con haz de luz de 1cm en la cubeta correspondiente y la lectura deberá ser a 0.08 a 0.13 unidades de absorbancia a 625 nm.

c) Siembra en Placas:

La suspensión bacteriana obtenida como se indicó en el paso anterior (b) es absorbida con un hisopo de algodón. El exceso de líquido se descarta oprimiendo el algodón contra la pared del tubo. Se inocula la superficie seca del agar Mueller Hinton por hisopado en tres direcciones rotando la placa 60 º cada vez, para asegurar una completa distribución del inóculo. Se dejan secar las placas de 3 a 5 minutos antes de proceder a aplicar los discos.

d) Aplicación de los discos:

Se aplican sobre la superficie del agar por medio de una pinza. Se debe tener el cuidado que los discos hagan buen contacto con dicha superficie, ejerciendo para ello ligera presión sobre los mismos. Transcurridos 15 minutos de la aplicación de los discos, las placas se incuban invertidas en la estufa a 35-37 ºC durante toda la noche (18-24 horas).

-Referencias bibliográficas cuyo contenido fundamenta las informaciones provistas:

-Perfomance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test; Approved Standard-Ninth Edition,Volume 26 Number 1,January 2006,NCCLS Document M2- A9.

-Perfomance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Sixteenth Informational Supplement, Disk Difussion, Volume 27 Number 1, January 2007, NCCLS M100-S17.

- Consenso sobre criterio de ensayo, interpretación e informe de las pruebas de sensibilidad en los BNNF de importancia clínica. Subcomisión de Antimicrobianos de SADEBAC, Asociación Argentina de Microbiología.

-XVII Curso Intensivo de Actualización en antimicrobianos “Dra Alicia Rossi”, XII Curso Latinoamericano de Actualización en Antimicrobianos. Servicio de Antimicrobianos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas

ANLIS “Doctor Carlos G. Malbran”, Abril 2003.

-Evaluation of the Hodge Test and the Imipenem-EDTA Double-Disk Synergy Test for Differentiating Metallo-Beta-Lactamase Producing Isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp. K. Lee, Y.S. Lim, D. Yong, J.H. Yum and Y. Chong. Journal of Clinical Microbiology, Oct 2003, p. 4623-4629.